As sequências genômicas da maioria dos vírus são conhecidas.Sondas de ácido nucleico que são segmentos curtos de DNA projetados para hibridizar com segmentos complementares de DNA ou RNA viral.A reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma técnica mais eficiente para detecção viral.Métodos de diagnóstico de alto rendimento foram desenvolvidos recentemente.
A. Técnica de hibridização de ácido nucleico
A hibridização de ácido nucleico, incluindo principalmente Southern blotting (Southern) e Northern blotting (Northern), é uma nova técnica em rápido desenvolvimento no campo de diagnóstico de vírus.A lógica do ensaio de hibridização é usar segmentos curtos de DNA (chamados de “sonda”) projetados para hibridizar com segmentos complementares de DNA ou RNA viral.Por aquecimento ou tratamento alcalino, DNA ou RNA alvo de fita dupla são separados em fitas simples e então são imobilizados em um suporte sólido.Depois disso, a sonda é adicionada e hibridizada com o DNA ou RNA alvo.Como a sonda é marcada com isótopo ou nuclídeo não radioativo, o DNA ou RNA alvo pode ser detectado por autorradiografia ou pelo sistema biotina-avidina.Como a maioria dos genomas virais foi clonada e sequenciada, eles podem ser detectados usando sequências específicas de vírus como sondas na amostra.Atualmente, os métodos de hibridização incluem: dot blot, hibridização in situ em células, DNA blotting (DNA) (Southern blot) e RNA blotting (RNA) (Northern blot).
Tecnologia B.PCR
Nos últimos anos, uma série de técnicas de amplificação de ácidos nucleicos in vitro foi desenvolvida com base em PCR, para testar vírus insensíveis ou não cultiváveis.A PCR é um método que pode sintetizar uma sequência específica de DNA por reação de polimerase in vitro.O processo de PCR inclui um ciclo térmico de três etapas: desnaturação, hibridização e extensão Em alta temperatura (93℃~95℃), o DNA de fita dupla é separado em duas fitas de DNA simples;então em baixa temperatura (37℃~60℃), dois primers de nucleotídeos sintetizados hibridizam aos segmentos de DNA complementares;enquanto que na temperatura apropriada para a enzima Taq (72℃), a síntese de novas cadeias de DNA começa a partir da extremidade 3' do primer usando DNA complementar como molde e nucleotídeos únicos como materiais.Assim, após cada ciclo, uma cadeia de DNA pode ser amplificada em duas cadeias.Repetindo esse processo, cada cadeia de DNA sintetizada em um ciclo pode ser usada como molde no próximo ciclo, e o número de cadeias de DNA é dobrado em cada ciclo, o que significa que a produção de PCR é amplificada em uma velocidade logarítmica de 2n.Após 25 a 30 ciclos, a produção de PCR é identificada por eletroforese, e os produtos específicos de DNA podem ser observados sob luz UV (254nm).Por sua vantagem de especificidade, sensibilidade e conveniência, a PCR foi adotada no diagnóstico clínico de muitas infecções virais, como HCV, HIV, CMV e HPV.Como a PCR é muito sensível, pode detectar o DNA do vírus no nível fg, a operação deve ser realizada com muito cuidado para evitar falsos positivos.Além disso, resultado positivo no teste de ácido nucleico não significa que haja vírus infeccioso vivo na amostra.
Com ampla aplicação da técnica de PCR, novas técnicas e métodos são desenvolvidos com base na técnica de PCR para diferentes finalidades de teste.Por exemplo, a PCR quantitativa em tempo real pode detectar a carga viral;A PCR in situ é usada para identificar infecção por vírus em tecidos ou células;A PCR aninhada pode aumentar a especificidade da PCR.Entre eles, a PCR quantitativa em tempo real tem se desenvolvido mais rapidamente.Muitas novas técnicas, como a sonda de hidrólise TaqMan, a sonda de hibridização e a sonda molecular beacon, foram combinadas na técnica de PCR quantitativa em tempo real, que é amplamente utilizada em pesquisas clínicas.Além de identificar com precisão a carga viral no fluido corporal dos pacientes, esse método também pode ser usado para detectar mutantes tolerantes a drogas.Portanto, a PCR quantitativa em tempo real é aplicada principalmente na avaliação do efeito curativo e na vigilância da tolerância a drogas.
C. Detecção de alto rendimento de ácidos nucleicos virais
Para atender às necessidades de diagnóstico rápido de novas doenças infecciosas emergentes, vários métodos de detecção de alto rendimento, como chips de DNA (DNA), foram estabelecidos.Para chips de DNA, sondas específicas são sintetizadas e anexadas a pequenos chips de silício em densidade muito alta para formar o microarray de sonda de DNA (DNA) que pode ser hibridizado com a amostra.O sinal de hibridização pode ser visualizado por microscópio confocal ou scanner a laser e posteriormente processado pelo computador e um enorme conjunto de dados sobre diferentes genes pode ser obtido.Existem dois tipos de chip de DNA.O “chip de síntese” é o seguinte: os oligonucleotídeos específicos são sintetizados diretamente nos chips.Outro é o chip de pool de DNA.Os genes clonados ou produtos de PCR são impressos ordenadamente na lâmina.A vantagem da tecnologia de chip de DNA é a detecção simultânea de uma enorme quantidade de sequências de DNA.A versão mais recente do chip de detecção de patógenos pode identificar mais de 1.700 vírus humanos de uma só vez.A tecnologia de chip de DNA resolveu os problemas dos métodos tradicionais de hibridização de ácidos nucleicos e tem aplicações muito amplas no diagnóstico viral e no estudo epidemiológico.
Horário da postagem: 23 de dezembro de 2020